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鏈霉親和素包被微孔板的基本操作方法
鏈霉親和素包被微孔板是預先將鏈霉親和素固定在聚苯乙烯微孔板表面的預制微孔板,廣泛應用于生物檢測實驗中,核心利用‌鏈霉親和素-生物素‌高親和力結合的特性,用于固定生物素化的分子探針。
鏈霉親和素對生物素具備親和力,結合常數可達到10^-15mol/L,且每分子鏈霉親和素可結合4個生物素分子,反應穩定快速,因此可以通過提前包被鏈霉親和素,一步法固定生物素化的抗體、肽段、寡核苷酸等捕獲分子,大幅簡化實驗流程。
實驗前準備:
提前從4℃冰箱取出微孔板,平衡至室溫(約15-30分鐘),未使用的微孔立即放回密封袋,4℃密封儲存,避免受潮。
準備好實驗所需試劑:生物素化捕獲分子(抗體/肽段/核酸探針)、待測樣本、洗滌液(一般為含0.05% Tween-20的PBST緩沖液)、封閉液(可選,若出廠已預封閉可省略)、檢測標記物(酶標/熒光標記二抗)。
通用操作步驟:
‌結合生物素化捕獲分子‌:將生物素化捕獲分子用合適緩沖液稀釋至工作濃度,每孔加入‌100μL‌稀釋后的捕獲分子,室溫孵育30-60分鐘(部分小分子探針可4℃孵育過夜),利用鏈霉親和素-生物素的親和力完成固定。
‌洗滌去除未結合分子‌:孵育結束后棄去孔內液體,每孔用200-300μL洗滌液洗滌3次,每次浸泡30秒,洗去未結合的游離捕獲分子,拍干孔內殘留液體。
‌封閉(可選)‌:若出廠未預封閉,或實驗對降低非特異性結合要求較高,每孔加入200μL 1-5% BSA封閉液,室溫封閉1-2小時,隨后洗滌3次拍干;出廠已預封閉的產品可省略此步。
‌捕獲待測靶標‌:加入稀釋好的待測樣本或標準品,每孔100μL,室溫孵育1-2小時(或按照實驗方案調整時間),讓靶標與固定好的捕獲分子特異性結合。
‌洗滌結合檢測抗體‌:棄去樣本洗滌3次拍干,加入酶標/熒光標記的檢測抗體,每孔100μL,室溫孵育1小時,再次洗滌3-5次去除未結合抗體。
‌信號檢測讀數‌:加入對應顯色/發光/熒光底物,按照檢測方法要求孵育后,立即用酶標儀/化學發光儀讀取信號值,根據標準曲線計算樣本中靶標的濃度。
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